Peter Sarnow tomonidan tahrirlangan, Stenford universiteti tibbiyot fakulteti, Stenford universiteti, Kaliforniya, 2020 yil 25 dekabrda tasdiqlangan (2020 yil 25 oktyabrda ko'rib chiqilgan)
Biz replikatsiya va evolyutsion saqlanish uchun zarur bo'lgan koronaviruslar-transkripsiya komplekslarining replikatsiyasidagi subbirliklarning o'zaro ta'siri haqida xabar beramiz.Biz nsp12 bilan bog'langan NiRAN domeni transda nukleozid monofosfat (NMP) transferaza faolligiga ega ekanligini isbotladik va uning maqsadi sifatida nsp9 (RNKni bog'lovchi oqsil) ni aniqladik.NiRAN Mn2+ ionlari va qo'shni saqlanib qolgan Asn qoldiqlariga tayanadigan reaksiyada NMP qismining konservatsiyalangan nsp9 amino terminaliga kovalent biriktirilishini katalizlaydi.NiRAN faolligi va nsp9 NMPylation koronavirus replikatsiyasi uchun zarur ekanligi aniqlandi.Ma'lumotlar bizga o'rnatilgan virus fermenti markerining bu faolligini RNK viruslari sinfida RNK sintezining boshlanishi funktsional va evolyutsion jihatdan izchil ekanligi haqidagi gipotezada oldingi kuzatuvlar bilan bog'lash imkonini beradi.
Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae va boshqa 12 oila) ning RNKga bog'liq RNK polimerazasi (RdRps) NiRAN deb nomlangan poliproteindan ajralib chiqadigan strukturaviy bo'lmagan oqsil (nsp)dagi amino-terminal (N-terminal) domeniga bog'langan. 1ab virusli asosiy proteazdan (Mpro) iborat.Ilgari, arterial virus NiRAN-RdRp nsp ning o'z GMPylation/UMPylation faoliyati haqida xabar berilgan, va u (hozirda noma'lum) virus va / yoki hujayra biopolimerization Things uchun nukleozid monofosfat (NMP) o'tkazish uchun vaqtinchalik yaratish taklif qilindi.Bu erda biz koronavirus (Odam Koronavirusi [HCoV]-229E va Og'ir o'tkir respirator sindrom Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) Mn2+ ga bog'liq NMPylanish faolligiga ega ekanligini ko'rsatamiz, u Mpro vositachiligida nsp9 hosil bo'lishi orqali nsp9 dan kelib chiqadi. N-terminal yonbosh nsps proteolitik ravishda chiqariladi, fosforamidat nsp9 ning N-terminalida birlamchi amin (N3825) bilan bog'lanadi.Uridin trifosfat bu reaktsiyada afzal nukleotiddir, ammo adenozin trifosfat, guanozin trifosfat va sitidin trifosfat ham mos keladigan substratlardir.Rekombinant koronavirus nsp9 va nsp12 oqsillari va genetik jihatdan ishlab chiqilgan HCoV-229E mutantlaridan foydalangan holda mutatsion tadqiqotlar NiRAN vositachiligida nsp9 NMPilatsiyasi va hujayra madaniyatida virus replikatsiyasi uchun zarur bo'lgan qoldiqlarni aniqladi.Ma'lumotlar NiRAN faol sayt qoldiqlari prognozini tasdiqladi va nsp9 N3826 qoldiqlarining nsp9 NMPylation va in vitro virus replikatsiyasida muhim rolini aniqladi.Bu qoldiq konservatsiyalangan N-terminal NNE tripeptidlar ketma-ketligining bir qismi bo‘lib, koronavirus oilasidagi nsp9 va uning gomologlarining yagona o‘zgarmas qoldig‘i ekanligi isbotlangan.Ushbu tadqiqot boshqa o'rnatilgan viruslarning NMPyatsiya faolligini funktsional o'rganish uchun mustahkam asos yaratadi va virusga qarshi dorilarni ishlab chiqish uchun mumkin bo'lgan maqsadlarni taklif qiladi.
Nidovirales musbat zanjirli RNK virusi turli umurtqali va umurtqasiz hayvonlarni yuqtiradi (1, 2).Buyurtma hozirda 14 ta oilani (3) o'z ichiga oladi, ulardan Koronavirus oilasi so'nggi 20 yil ichida keng o'rganilgan.O'sha paytda hayvonlarning xostlaridan uchta zoonotik koronavirus paydo bo'lgan va odamlarda og'ir respirator infektsiyalarning keng ko'lamli tarqalishiga sabab bo'lgan.Jumladan, og'ir o'tkir yuqumli kasalliklardan kelib chiqqan doimiy pandemiyalar.Nafas olish sindromi Koronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidoviruslar umumiy genom tashkilotiga ega va membrana bilan bog'langan replikatsiya-transkripsiya kompleksining (RTC) sub birligi 5-?²-terminalning uchdan ikki qismida va virus zarrasining asosiy tarkibiy bo'linmasida, shuningdek, ba'zi aksessuarlarda kodlangan. .Protein, genomning 3??² oxirgi uchdan birida kodlangan (1).Planar viruslarning bir oilasidan (Monoviridae) (8) tashqari, barcha ichki o'rnatilgan viruslar RTC subunitlarini ikkita katta ochiq o'qish ramkalarida (ORF) ORF1a va ORF1b kodlaydi, ular genomik RNK dan tarjima qilinadi.ORF1a poliprotein (pp) 1a ni kodlaydi va ORF1a va ORF1b birgalikda pp1abni kodlaydi.ORF1a tomonidan kodlangan asosiy proteazaning (Mpro) umumiy ishtirokida pp1a ham, pp1ab ham proteolitik tarzda turli xil strukturaviy bo'lmagan oqsillarga (nsps) qayta ishlanadi, ular 3CLpro deb ham ataladi, chunki u picornavirusning 3Cpro bilan homologiyaga ega ( 9).Ushbu nsps katta dinamik RTCga yig'ilgan deb hisoblanadi, genomik RNK (replikatsiya) va subgenomik RNK to'plami (transkripsiya) sintezini katalizlaydi va ORF1b (10? ?) ning quyi oqimida joylashgan ORF ifodasini muvofiqlashtirish uchun ishlatiladi. ?12).
Asosiy RTC RNKga bog'liq RNK polimeraza (RdRp) (13), superfamiliya 1 helikaz (HEL1) (14, 15) va bir nechta RNKni qayta ishlash fermentlarini o'z ichiga oladi, ular asosan ORF1b va koronavirus oilasida kodlangan, nsp12-nsp16 va o'z ichiga oladi. Arterioviridae oilasida nsp9-nsp12 (qarang: 10ââ 12).RdRp va HEL1 qush uyasi virusining ikkita (beshdan bir) saqlanib qolgan domenini ifodalaydi va boshqa RNK viruslari orasida homologiyaga ega.Yadro replikazasiga boshqa subbirliklar, shu jumladan pp1a ning karboksi-terminal (C-terminal) hududidan, Mpro ning quyi oqimidan (mos ravishda koronavirus nsp5 va arterial virus nsp4) chiqarilgan bir nechta kichik nsps yordam beradi deb ishoniladi.Ular cheklangan oilaga xos himoyaga va turli faoliyatga ega (10ââ12 havolada ko'rib chiqilgan).
Nisbatan yaqinda, barcha ichki o'rnatilgan viruslarda RdRp ga ulashgan amino terminalda (N-terminus) noyob ketma-ketlik motivi xususiyatlariga ega bo'lgan domen topildi, ammo boshqa RNK viruslari yo'q (16).Joylashuvi va nukleotid transferaza (nukleozid monofosfat [NMP] transferaza) faolligiga asoslanib, bu domen NiRAN (Nestvirus RdRp bilan bog'liq nukleotid transferaza) deb nomlanadi.NiRAN-RdRp ning ikki domenli birikmasi Coronaviridae oilasida nsp12 va Arterioviridae oilasida nsp9 ni tashkil qiladi va boshqa nestoviridaelarda NiRAN-RdRp virusli poliproteindan mustaqil nsp sifatida chiqarilishi kutilmoqda.Koronavirusda NiRAN domeni ??1/450 qoldiqni o'z ichiga oladi va bog'lovchi hudud (16?19) orqali C-terminal RdRp domeniga ulanadi.Ot arterit virusida (EAV) (Arteriviridae) rekombinant nsp9 Mn2+ ionga bog'liq (o'z-o'zidan) UMPylation va GMPylation faolligini ko'rsatadi, ular nestovirusning uchta saqlanib qolgan ketma-ketlik asoslariga, AN, BN va CN ketma-ketlikdagi qoldiqlarga bog'liq.Bu erda N NiRANni bildiradi) (16).Ushbu naqshlarning N-terminal yon tomoni kamroq konservativ motif preAN.Ushbu qoldiqlarning ba'zilari uzoqdan bog'liq bo'lgan protein kinazlarda ham saqlanib qoladi, bu erda ular nukleozid trifosfat (NTP) bilan bog'lanish va katalitik faollikda ishtirok etishi ko'rsatilgan (20, 21).Ushbu kuzatishga muvofiq, Pseudomonas syringae-dan psevdokinaz SelO tarkibidagi bir nechta asosiy faol sayt qoldiqlari yaqinda nashr etilgan SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkompleksi bilan birlashtirilishi mumkin.Saqlangan Koronavirus NiRAN qoldiqlari elektron mikrostrukturada joylashgan.Rekombinant oqsil (17).Taxminlarga ko'ra, hujjatlashtirilgan (o'z-o'zidan) U / GMPylation NMP ni (hozirda noma'lum) substratga o'tkazish uchun vaqtinchalik holatni keltirib chiqaradi (16) va NiRAN va protein kinaz o'rtasidagi strukturaviy o'xshashlik (17, 19) ) Bu gipotezadir. NiRAN boshqa oqsillarni o'zgartiradi.
Ko'pgina xususiyatlar, shu jumladan uning o'ziga xos va o'ziga xos tizimli o'zaro bog'liqligi va RdRp dan genetik ajralish, NiRANni ularning paydo bo'lishi va o'ziga xosligi uchun juda muhim bo'lgan ichki o'rnatilgan viruslar uchun oqilona kalit tartibga soluvchi fermentga aylantiradi.Ilgari, genom / subgenomik tarjima yoki replikatsiya / transkripsiyani tartibga solish uchun NiRANni o'z ichiga olgan uchta mumkin bo'lgan funksiya chaqirilgan.O'sha paytda mavjud bo'lgan kam va to'liq bo'lmagan ma'lumotlarni hisobga oladigan bo'lsak, har bir funktsiya o'zining afzalliklari va kamchiliklariga ega (16).Ushbu tadqiqotda biz ikki avlod vakillari bo'lgan koronaviruslarning biokimyoviy va teskari genetik tadqiqotlarini birlashtirishni maqsad qilganmiz va topilmalarimizni koronavirus oilasining tabiiy mutatsiyasining evolyutsion foniga qo'yib, ushbu sirli dunyo haqida tushunchaga ega bo'lamiz.Biz RTCdagi tabiiy maqsadlarni aniqlash orqali NiRANni tushunishdagi katta yutuqlar haqida xabar beramiz, bu (uchta mavjud faraz orasida) bu domenning ichki virus RNK sintezini boshlashdagi roliga hissa qo'shadi.Ushbu tadqiqot, shuningdek, virus xost interfeysida NiRANning boshqa rollari uchun imkoniyatlarni ochadi.
Korona virusi nsp12 bilan bog'liq NiRAN domenining fermentativ xususiyatlarini tavsiflash uchun biz E. coli da inson koronavirusi 229E (HCoV-229E) nsp12 rekombinant shaklini C-terminusda His6 yorlig'i bilan ishlab chiqardik va birlashtirdik. [a32-P ] bilan protein. Materiallar va usullarda tavsiflanganidek, MnCl2 ishtirokida NTP bilan birga inkubatsiya qiling.Reaktsiya mahsulotini tahlil qilish nsp12 (106 kDa) bilan birgalikda ko'chib yuruvchi radioyorliqli oqsil mavjudligini ko'rsatdi, bu esa koronavirus nsp12 uridin monofosfat (UMP) bilan afzallik bilan hosil bo'lgan kovalent oqsil-NMP qo'shimchalarini shakllanishini katalizlashini ko'rsatdi (1A-rasm) va B).Miqdoriy tahlil shuni ko'rsatdiki, boshqa nukleotidlar bilan solishtirganda, UMP qo'shilishining signal intensivligi 2 dan 3 barobarga oshdi (1C-rasm).Ushbu ma'lumotlar koronavirusning NiRAN domenining prognoz qilingan NMP transferaza faolligiga mos keladi (16), ammo koronavirus va arterial virusning NiRAN domenining nukleotid imtiyozlari boshqacha ekanligini ko'rsatadi.
HCoV-229E nsp12 ning o'z-o'zidan NMPillanish faolligi.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) belgilangan [a-32P] NTP bilan 6 mM MnCl2 ishtirokida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi (batafsil ma'lumot uchun Materiallar va usullarga qarang).Reaktsiya mahsulotlari SDS-PAGE orqali ajratildi va Coomassie yorqin ko'k bilan bo'yaldi.(B) Radioyorliqli oqsil fosforli tasvir yordamida ingl.Nsp12-His6 va oqsil molekulyar massasi belgilarining pozitsiyalari (kilodaltonlarda) A va B da ko'rsatilgan. (C) Radioaktiv signalning intensivligi (o'rtacha ± SEM) uchta mustaqil tajribadan aniqlangan.*P≤0,05.Signal kuchi (foiz) UTP bilan bog'liq.
NiRAN bilan bog'liq ferment faolligi hujayra madaniyatida EAV va SARS-CoV replikatsiyasi uchun muhim ekanligi ko'rsatilgan bo'lsa-da (16), o'ziga xos NiRAN funktsiyasi va potentsial maqsadlar hali aniqlanmagan.NiRAN va oqsil kinaziga o'xshash qatlamlarga ega bo'lgan oqsillar oilasi o'rtasidagi yaqinda xabar qilingan strukturaviy o'xshashlik (17, 22) bizni NiRAN boshqa oqsillarning NMPillanishini katalizlashi haqidagi gipotezani sinab ko'rishga undadi.Biz HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) tomonidan kodlangan strukturaviy bo'lmagan oqsillarni o'z ichiga olgan potentsial gomologik maqsadlar to'plamini yaratdik, ularning har biri C-terminal His6 yorlig'ini o'z ichiga oladi (SI ilovasi, S1 jadvali) va bu oqsillarni nsp12 bor yoki yo'qligida [a32-P] uridin trifosfat ([a32-P]UTP) bilan inkubatsiya qiling.E. coli da ishlab chiqarilgan sigir zardobidagi albumin va MBP-LacZa termoyadroviy oqsili nazorat sifatida xizmat qildi (2A-rasm, 1 dan 7 gacha).Radioyorliqli oqsil natriy dodesil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) va avtoradiografiya yordamida tahlil qilindi va nsp12 va nsp9 ni o'z ichiga olgan reaktsiyada kuchli radioaktiv signal mavjudligi aniqlandi.Signalning joylashuvi nsp9 ning molekulyar massasiga to'g'ri keladi, bu nsp9 ning nsp12 vositachiligidagi UMPilatsiyasini ko'rsatadi (2B-rasm, 7-trek).Boshqa hech qanday sinov oqsillari UMPylangani topilmadi, bu bizni nsp9 nsp12 ning o'ziga xos substrati degan xulosaga keldi.1-rasmda ko'rsatilgan o'z-o'zidan NMPylation ma'lumotlariga muvofiq, nsp12 barcha to'rt NMPni nsp9 ga o'tkazishga qodir, garchi samaradorlik har xil bo'lsa-da, UMP> adenozin monofosfat (AMP)> guanozin monofosfat (GMP)> sitidin monofosfat (CMP) ) ( Rasm).3 A va B).Ushbu tahlilda foydalanilgan sharoitlarda (reaktsiya va ta'sir qilish vaqtini qisqartirish, nsp12 kontsentratsiyasini kamaytirish; materiallar va usullar) nsp12 ning o'z-o'zidan NMPilatsiyasini aniqlab bo'lmadi (2B-rasm, 7-bo'lak va 1B-rasmni solishtiring), bu UMP nsp12 dan nsp9 ga ko'chirilgan samarali (Va bir nechta tur) ekanligini isbotladi.UMP transferaza faolligi 3C-rasmda ko'rsatilganidek, Mn2+ ionlarining mavjudligini talab qiladi, Mg2+ ishtirokida faqat minimal UMP transferaza faolligi kuzatilgan, qolgan ikkita ikki valentli kationlar ishtirokida esa faollik kuzatilmagan.Xuddi shunday ma'lumotlar sitidin trifosfat (CTP), guanozin trifosfat (GTP) va adenozin trifosfat (ATP) o'z ichiga olgan NMPylation tahlillarida olingan (SI ilovasi, S1-rasm).
HCoV-229E nsp12 vositachiligida nsp9 ning UMPilatsiyasi.HCoV-229E nsp12-His6⁺ vositachiligidagi UMPillanish faolligini baholash uchun bir qator protein substratlari (jumladan, sigir zardobi albumini, MBP-lacZa va ORF1a tomonidan kodlangan His6 C-terminali bilan etiketlangan HCoV-229E nsps seriyasi) ishlatilgan. oqsil.Proteinni [a-32P] UTP bilan 10 daqiqa davomida materiallar va usullarda ta'riflanganidek, nsp12 (A) yoki mavjud bo'lmaganda (B) inkubatsiya qiling.A va B tepasida Coomassie Brilliant Blue bilan bo'yalgan SDS-poliakrilamid jeli ko'rsatilgan va A va B pastki qismida mos keladigan avtoradiogrammalar ko'rsatilgan.Oqsil molekulyar massasi markerining holati (kilodaltonlarda) chap tomonda berilgan.nsp12-His6 (B, tepa) pozitsiyasi va nsp12-His6 ning nsp9-His6 (B, 7-yo'lak) bilan inkubatsiyasi paytida kuzatilgan radioaktiv signal ham ko'rsatilgan, bu [a-32P]UMP dan nsp9-His6 ga o'tishini ko'rsatadi. (12,9 kDa), bu boshqa sinovdan o'tgan oqsillar uchun kuzatilmagan.
HCoV-229E NiRAN vositachiligida nsp9 NMPilatsiyasining biokimyoviy va virusologik tavsifi.(A va B) Reaksiyada ishlatiladigan nukleotid ko-substratning roli.Nsp12-His6 va nsp9-His6 aralashtiriladi va standart NMPilatsiya tahlilida turli [a-32P] NTPlar ishtirokida inkubatsiya qilinadi.(A, tepada) Coomassie-bo'yalgan nsp9-His6 SDS-PAGE bilan ajratilgan.(A, pastki) Jelning bir xil maydonining avtoradiografi.(B) Belgilangan nukleotid kofaktori ishtirokidagi nisbiy faollik (o'rtacha ± SEM) uchta mustaqil tajribadan aniqlanadi.*P≤0,05.C) Metall ionlarining roli.[a-32P] UTP va har birining konsentratsiyasi 1 mM bo'lgan turli metall ionlari ishtirokida standart NMPylation testi ko'rsatilgan.C da, tepada, Coomassie bo'yalgan nsp9-His6 ko'rsatilgan va Cda, pastki qismida, mos keladigan avtoradiografiya ko'rsatilgan.Belgilangan oqsil hajmi (kilodaltonda) A va C ning chap tomonida ko'rsatilgan. (D) HCoV-229E nsp12-His6 ning ko'rsatilgan aminokislota o'rnini bosuvchi mutant shakli tasvirlanganidek [a-32P]UTPda joylashgan. Materiallar va usullarda.NMPylation reaktsiyasida hosil bo'lgan radioyorliqli nsp9-His6 fosforlanish ko'rish orqali aniqlanadi (D, yuqori).Yovvoyi turdagi (wt) oqsil bilan solishtirganda nisbiy faollik D da ko'rsatilgan va pastki uchta mustaqil tajribadan o'rtacha (±SEM) sifatida olingan.Yulduzchalar saqlanmagan qoldiqlarni almashtirishni bildiradi.(E) Infektsiyadan 24 soat o'tgach olingan p1 hujayralarining madaniyat supernatantidagi virus titri blyashka tahlili bilan aniqlandi.Muhandislik qilingan HCoV-229E mutantining NiRAN domenidagi kodon almashtirishlari ko'rsatilgan (qoldiqlarni raqamlash ularning pp1abdagi pozitsiyasiga asoslanadi).Nazorat sifatida replikatsiya nuqsonli RdRp faol sayt mutant nsp12_DD4823/4AA ishlatilgan.
NiRANning faol joyini chuqurroq tushunish va nsp9-ga xos NMP transferaza faoliyati bilan bog'liq qoldiqlarni aniqlash uchun biz mutatsiya tahlilini o'tkazdik, unda biz NiRAN AN, BN va CN motivlarida konservativ qoldiqlarni almashtirdik ( 16) Bu Ala (SI ilovasi, S2-rasm).Bundan tashqari, konservativ Arg-to-Lys yoki Lys-to-Arg almashtirishlarining ta'siri ikki holatda baholandi.Koronaviruslar va boshqa ichki oʻrnatilgan viruslarning NiRAN domenida saqlanmaydigan yoki kamroq saqlanib qolgan qoldiqlar (salbiy) nazorat sifatida Ala bilan almashtiriladi. K4116A (preAN motifida), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motif) oʻrniga BN) va D4280A (CN) nsp12 orqali nsp9 NMPilatsiyasini sezilarli darajada kamaytiradi yoki hatto yo'q qiladi, konservativ almashtirishlarga ega bo'lgan oqsillar (R4178K), K4116R) o'z faolligining 60% va 80% ni saqlab qoladi, bu ularning tegishli tomonidagi cheklovlarning yumshatilishini ko'rsatadi. zanjirlar fizik-kimyoviy jihatdan sezgir (3D-rasm).E4145A, D4273A, F4281A va D4283A bir nechta saqlanib qolgan qoldiqlarni almashtirish juda kam zararli va nsp9 UMPylation faqat o'rtacha darajada kamayadi.Shunga o'xshash natijalar boshqa NTPlarni o'z ichiga olgan nsp9 NMPylation reaktsiyalarida (3D-rasm va SI ilovasi, S3-rasm) olingan bo'lib, ma'lum aminokislotalarni almashtirishda kuzatilgan ta'sirlar ishlatiladigan nukleotid ko-substrat turiga bog'liq emasligini tasdiqlaydi.Keyinchalik, biz ushbu nsp12 almashtirishlarining hujayra madaniyatida koronaviruslarning replikatsiyasiga ta'sirini sinab ko'rdik.Shu maqsadda biz 5-7 hujayrani transkripsiya qilish uchun rekombinant vaksiniya virusida (23, 24) klonlangan tegishli genetik jihatdan yaratilgan qo'shimcha DNK (cDNK) shablonlaridan foydalandik.Ushbu hujayralarda ishlab chiqarilgan yuqumli virus nasllarini titrlash ko'pchilik HCoV-229E NiRAN mutantlarini amalga oshirish mumkin emasligini ko'rsatdi (3E-rasm).Hayotiy bo'lmagan virusli mutantlar guruhi in vitro NMP transferaza faolligini yo'q qilish yoki sezilarli darajada kamaytirishi ko'rsatilgan muqobillarni o'z ichiga oladi (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), ammo yana ikkita alternativa mavjud (K4116R, E4805A) % zaxiralanganmi?Ularning in vitro NMPylation faoliyati qo'shimcha cheklovlar bilan bog'liqligini ko'rsatadi.Xuddi shunday, NiRAN ning in vitro NMPylyatsiya faolligining o'rtacha pasayishiga olib kelgan boshqa ikkita mutatsiya (R4178K, F4281A) jonli viruslarni ishlab chiqardi, ammo bu viruslar replikatsiya orqali titrlarni sezilarli darajada kamaytirdi.3D-rasmda ko'rsatilgan in vitro faollik ma'lumotlariga mos ravishda, koronavirus va/yoki boshqa ichki o'rnatilgan viruslarda (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) saqlanmagan to'rtta boshqa qoldiq o'rnini bosadi (8, 16) nasl, borligiga qaramay, yashovchan viruslarni ishlab chiqardi. yovvoyi turdagi virusga nisbatan o'rtacha pasaytirilgan titr (3E-rasm).
NiRAN vositachiligidagi NMP transferaza faolligi faol RdRp domeniga bog'liqligini o'rganish uchun RdRp C motifidagi ikki valentli metall ionlarini (11) muvofiqlashtirishda ishtirok etgan ikkita konservalangan Asp qoldig'i Ala bilan almashtirildi.Olingan protein nsp12_DD4823/4AA saqlaydi. uning nsp9 NMPylation faolligi, bu nsp12 vositachiligida in vitro nsp9 NMPylation faoliyati polimeraza faolligini talab qilmasligini ko'rsatadi (SI ilovasi, S4-rasm).
Nsp12 uchun nsp9-ga xos NMP transferaza faolligini o'rnatganimizdan so'ng, biz NMP-nsp9 qo'shimchasini massa spektrometriyasi (MS) bilan tavsiflashga harakat qildik.Rekombinant HCoV-229E nsp9 ning to'liq oqsil massasi spektri 12,045 Da cho'qqisini ko'rsatdi (4A-rasm).Nsp12 qo'shilishi nsp9 sifatini o'zgartirmadi, bu nsp12 va nsp9 ishlatilgan sharoitlarda (denaturatsiya) barqaror kompleks hosil qilmasligini ko'rsatadi (4A-rasm).UTP va GTP mavjud bo'lganda, nsp9 va nsp12 ni o'z ichiga olgan reaktsiyaning massa o'lchovi UTP ning oqsil massasi 306 Da ga, GTP ning oqsil massasi esa 345 Da ga harakat qilganini ko'rsatdi, bu har bir nsp9 molekulasi UMP yoki GMP ni bog'lashini ko'rsatdi. (4-rasm) C va D).Taxminlarga ko'ra, NiRAN vositachiligida nsp9 NMPilatsiyasi uchun zarur bo'lgan energiya NTP gidrolizidan va pirofosfatning ajralib chiqishidan kelib chiqadi.Ushbu reaksiyada nsp12 (ferment) dan 10 baravar ortiq molyar nsp9 (maqsad) ishlatilgan bo'lsa-da, nsp9 ning deyarli to'liq NMPillanishi kuzatildi, bu nsp12 va nsp9 o'rtasidagi o'zaro ta'sir qisqa muddatli ekanligini va nsp12 ko'proq nsp9 ni NMPylashi mumkinligini ko'rsatadi. in vitro molekulasi.
nsp12 va UTP yoki GTP ishtirokida nsp9 ning yagona NMPilatsiyasi.HCoV-229E nsp9 ning dekonvolyutsiyalangan to'liq oqsil massa spektri ko'rsatilgan (SI ilovasi, S1-jadval) (AD).(A) faqat nsp9, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP ishtirokida, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP ishtirokida.
Nsp12 tomonidan UMPylangan nsp9 qoldiqlarini aniqlash uchun nsp9-UMP tripsin bilan parchalandi.Olingan peptidlar nano-yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC) bilan ajratilgan va tandem massa spektrometriyasi (MS/MS) orqali onlayn tahlil qilingan.Byonic dasturiy ta'minot to'plami (Protein Metrics) yordamida ma'lumotlarni tahlil qilish N-terminal aminokislotalarning UMPilatsiyasini ko'rsatdi.Bu qo'lda tasdiqlanadi.[UMP]NNEIMPGK prekursor peptidining tandem massa spektri (SI ilovasi, S5A-rasm) 421 m/z tezlikda fragmentni aniqladi, bu UMP nsp9 ning 1 qoldig'i bilan bog'lanishini ko'rsatadi.
Nsp9 ning N-terminalida Asn Orthocoronavirinae a'zolari orasida saqlanadi (SI ilovasi, S6-rasm).Biz N-terminalning asosiy amin azotini UMP uchun eng ko'p qabul qiluvchi deb hisoblasak ham, biz N-terminalda NMP ulanishining qo'shimcha dalillarini olishga qaror qildik.Shu sababli, HPLC tomonidan tozalangan NMPylanmagan va NMPylangan N-terminal peptid nsp9 aseton va natriy siyanoborogidrid ishtirokida olingan.Bunday sharoitda faqat erkin birlamchi aminlar propil (25) bilan o'zgartirilishi mumkin.NNEIMPGK ketma-ketligiga ega N-terminali nsp9-dan olingan peptid ikkita asosiy aminni o'z ichiga oladi, biri Asnning N-terminusida, ikkinchisi esa C-terminusdagi Lys yon zanjirida.Shuning uchun propil guruhlari ikkala uchida ham kiritilishi mumkin.NMPillanmagan peptidlarning ekstraksiya qilingan ion xromatogrammalari SI ilovasida, S5B-rasmda ko'rsatilgan.Kutilganidek, N-terminal va C-terminal (mono) propillangan (SI ilovasi, S5B-rasm, yuqori chiziq) va dipropillangan peptidlar (SI ilovasi, S5B-rasm, pastki chiziq) aniqlanishi mumkin.Bu naqsh nsp9 ning NMPyated N-terminal peptididan foydalanish bilan o'zgaradi.Bunday holda, faqat C-terminal propillangan peptidlarni aniqlash mumkin, lekin N-terminal propillangan peptidlar va dipropillangan peptidlar aniqlanmaydi (SI ilovasi, S5C-rasm), bu UMP N-terminal birlamchi aminga o'tkazilganligini ko'rsatadi Buning oldini olish uchun guruhga oʻzgartirishlar kiritishga yoʻl qoʻymaydi.
Keyinchalik, maqsad uchun maxsus cheklovlarni aniqlash uchun nsp9 ning N-terminusidagi saqlangan qoldiqlarni (Ala yoki Ser bilan) almashtiramiz yoki yo'q qilamiz.NiRAN nsp9 N-terminal qoldig'ining asosiy omini bilan nsp9-NMP qo'shimchasini hosil qilishini ko'rsatadigan MS ma'lumotlarimizga asoslanib, biz nsp9 NMPilyatsiyasi nsp9 N-terminalini chiqarish uchun virusli asosiy proteazni (Mpro, nsp5) talab qiladi, deb faraz qildik. uning poliprotein kashshofidir.Ushbu gipotezani sinab ko'rish uchun biz E. coli da nsp9 ni o'z ichiga olgan nsp7-11 prekursor oqsilini ishlab chiqardik va [a-32P] UTP (materiallar va usullar) ishtirokida standart NMPylation testini o'tkazdik.5A-rasmda (3-qator) ko'rsatilganidek, kesilmagan nsp7-11 prekursori nsp12 bilan radioyorliqlanmagan.Bundan farqli o'laroq, agar nsp7-11 rekombinant nsp5 tomonidan nsp9 (va boshqa nsps) ni prekursordan chiqarish uchun parchalansa, nsp9 bilan ko'chib o'tadigan radio etiketli oqsil aniqlanadi, bu bizning NiRAN va N- kovalent nsp9-NMP qo'shimchalarining selektiv shakllanishi haqidagi xulosamizni tasdiqlaydi. .N-terminal Asn ning terminal birlamchi amini (pp1a/pp1ab da 3825-pozitsiya).Ushbu xulosa N-terminusda bir yoki ikkita qo'shimcha qoldiqni o'z ichiga olgan nsp9 konstruktsiyasidan foydalangan holda tajribalar bilan ham tasdiqlanadi.Ikkala holatda ham nsp9 ning NiRAN vositachiligida UMPylation bekor qilindi (SI ilovasi, S7-rasm).Keyinchalik, biz nsp9 ning N-terminalida 3825-NNEIMPK-3832 peptid ketma-ketligidan o'chirilgan bir yoki ikkita Asn qoldiqlari bo'lgan oqsilni ishlab chiqardik.Ikkala holatda ham nsp9 UMPylation butunlay bloklandi (5B-rasm), bu haqiqiy nsp9 N-terminalining NMP retseptorlari rolini o'ynashiga qo'shimcha dalil beradi.
Nsp9 ning proteolitik qayta ishlanishi va N-terminal qoldiqlarining nsp12 vositachiligidagi UMPylationdagi roli.(A) nsp9 UMPylation uchun bepul nsp9 N-terminal kerak.Nsp7-11-His6 rekombinant Mpro (nsp5-His6) mavjudligi yoki yo'qligida UTP ni o'z ichiga olgan NMPylation aniqlash buferida 30 °C da oldindan inkubatsiya qilinadi.3 soatdan so'ng, Materiallar va usullarda tavsiflanganidek nsp12-His6 qo'shish orqali NMPylation tahlilini boshlang.Nazorat sifatida nsp5-His6 (1-qator) va nsp9-His6 (2-qator) ni o'z ichiga olgan reaksiya ishlatilgan.10 daqiqadan so'ng reaksiya tugatildi va reaktsiya aralashmasi SDS-PAGE bilan ajratildi.Protein Coomassie Brilliant Blue (A, tepa) bilan bo'yalgan.Nsp7-11-His6 prekursori va nsp5-His6 vositachiligida bo'linishi natijasida qayta ishlangan mahsulot o'ng tomonda ko'rsatilgan.(B) Nsp9-His6 variantida bir yoki ikkita N-terminal Asn qoldig'i yo'q (qoldiq pp1a/pp1ab dagi holatga ko'ra raqamlash) va nsp12-His6 va [a-32P] UTP bilan tozalanadi va inkubatsiya qilinadi.B, Coomassie bilan bo'yalgan SDS-PAGE yuqorida ko'rsatilgan, B, mos keladigan avtoradiograf pastda ko'rsatilgan.Molekulyar og'irlik belgisining holati (kilodaltonlarda) chap tomonda ko'rsatilgan.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminalida saqlangan qoldiqlar Ala yoki Ser bilan almashtirildi va nsp12-His6 vositachiligidagi UMPylation reaktsiyasida bir xil miqdordagi protein ishlatilgan.Replikatsiyaga ega bo'lmagan RdRp motifi C qo'sh mutant DD4823/4AA salbiy nazorat sifatida ishlatilgan.
Nsp9 ning N-terminali (ayniqsa 1, 2, 3 va 6 pozitsiyalari) Orthocoronavirinae subfamiliyasi a'zolari orasida juda saqlanib qolgan (SI ilovasi, S6-rasm).Ushbu qoldiqlarning nsp12 vositachiligidagi nsp9 NMPilatsiyasidagi mumkin bo'lgan rolini o'rganish uchun nsp9 ning N-terminalidagi ikkita ketma-ket Asn qoldiqlari Ala yoki Ser bilan almashtirildi (yakka yoki kombinatsiyalangan).Yovvoyi turdagi nsp9 bilan taqqoslaganda, N3825 ni Ala yoki Ser bilan almashtirish nsp12 vositachiligida UMPylation ikki baravardan ko'proq qisqarishiga olib keldi (5C-rasm).NMPillanish N-terminal qoldig'ining yon zanjiri o'rniga N-terminal asosiy aminida sodir bo'ladi degan xulosamizga muvofiq, biz N3825A va N3825S almashtirilishi bilan muhim qoldiq NMPilatsiyani kuzatdik.Qizig'i shundaki, agar ikkinchi Asn Ala yoki Ser bilan almashtirilsa, nsp9 UMPylation kuchliroq (10 martadan ko'proq) kamayadi, 3, 4 va 6-pozitsiyalarda Ala almashinuvi nsp9 UMPylyatsiyasiga faqat o'rtacha ta'sir qiladi (2-rasm). ).5C).Shunga o'xshash natijalar ATP, CTP yoki GTP yordamida olingan (SI ilovasi, S8-rasm).Birgalikda bu ma'lumotlar N2826 ning (nsp9 da 2-pozitsiya) nsp9 NMPylationdagi asosiy rolini ko'rsatadi.
Nsp9 ning N-terminallari va NMPylation o'rtasidagi funktsional korrelyatsiyaning qo'shimcha dalillarini olish uchun biz Koronaviruslar oilasining nsp9 ketma-ketligini (104 va 113 qoldiq orasida o'zgarib turadigan) bir nechta ketma-ket tekislashni (MSA) amalga oshirdik (SI ilovasi, rasm). S6).Hammasi bo'lib, har xil sutemizuvchilar, qushlar va sudraluvchilarni yuqtiruvchi Orthocoronavirinae kenja oilasining 5 avlodining 47 turida (ma'lum va taxminiy) jami 8 ta qoldiq o'zgarmas ekanligi aniqlandi.Eng keng qamrovli o'zgarishlar, jumladan, o'chirish va qo'shish, oldingi tizimli tadqiqotlar (26 ??28) tomonidan aniqlangan nsp9 ning ikkilamchi struktura elementlari orasidagi tsikllarda kuzatilgan.Nsp9 ning C-terminal qismining b ip va a spiralida beshta o'zgarmas qoldiq topildi.Uchta o'zgarmas qoldiq nsp9 ning N terminalining NNE motivini tashkil qiladi.Aniqlanishicha, bu motifning ikkinchi Asn faqat oʻzgarmas qoldiq boʻlib, u ham uzoqdan turuvchi qurbaqa koronavirusining gipotetik nsp9 tomonidan taqsimlanadi va Alphaletovirusning Letovirinae subfamiliyasidagi Microhyla letovirus 1 turini ifodalaydi.NSP9 ikkilamchi struktura elementlarida qoldiqlarning saqlanishi katlama yoki ma'lum RNK bog'lanish xususiyatlarini saqlab qolish uchun tizimli mulohazalar bilan ratsionalizatsiya qilinishi mumkin.Biroq, bu mulohaza NNE ning saqlanishiga taalluqli ko'rinmaydi va ushbu tadqiqotdan oldin tripeptidlar ketma-ketligining o'zgarishini cheklaydigan cheklovlar tabiati butunlay yashiringan.
Koronavirus replikatsiyasida nsp9-NMPylation va NNE saqlanishining ahamiyatini aniqlash uchun biz HCoV-229E mutantlarini ishlab chiqdik, ular nsp9 N-terminal qoldiqlarining bir yoki ikki marta almashtirilishini tashiydi, bu nsp9 NMPylation in vitro zararli ekanligini ko'rsatadi.Boshlashdan oldin, biz ushbu almashtirishlar (nsp8 | 9 bo'linish joyi yaqinida) C-terminal pp1a mintaqasining proteolitik ishloviga ta'sir qiladimi degan savolga javob berishga harakat qilamiz.Nsp9 ning N-terminusida mos keladigan almashtirishlarni o'z ichiga olgan nsp7-11 poliprotein konstruktsiyalari to'plami E. coli da ishlab chiqarilgan va rekombinant Mpro bilan kesilgan.To'rtta joyning proteolitik bo'linishi (shu jumladan nsp9 yonbosh joyi) Mpro vositachiligida nsp8|9 bo'linishiga xalaqit beradigan ushbu oqsillardagi tarkibiy o'zgarishlar bundan mustasno, kiritilgan almashtirishlar (SI ilovasi, S9-rasm) sezilarli darajada ta'sir qilmaydi (Yoki boshqa) veb-sayt.
Huh-7 xujayralari genom uzunlikdagi HCoV-229E RNK bilan transfektsiya qilindi, nsp9 N terminalida konservalangan NNE tripeptidlarida (N3825, N3826 va E3827) Ala yoki Ser almashtirishlarini kodlaydi, bu mutatsiyalarning aksariyati halokatli ekanligini ko'rsatadi.Biz N-terminal Asn (N2835A yoki N2835S) ning Ser yoki Ala-ni almashtirish orqali virusni qutqara oldik, ammo virusni NNE ketma-ketligidagi boshqa bitta va juft mutatsiyalar bilan tiklay olmadik (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (5D-rasm).
Ushbu natijalar to'qima madaniyatida koronaviruslarning replikatsiyasi cheklanganligini (bir xil yoki o'xshash) ko'rsatadi, organizmdagi nsp9 NMPylyatsiya joylarining tabiiy mutatsiyasini cheklaydi va bu javobning koronaviruslarning hayot aylanishidagi asosiy rolini qo'llab-quvvatlaydi.
Oxirgi tajribalar to‘plamida biz SARS-CoV-2 nsp12 va nsp9 etiketli His6 C-terminalini va E. coli da nsp12 ning ikkita mutant shaklini ishlab chiqardik.NiRAN va RdRp domenlaridagi faol sayt qoldiqlari mos ravishda Ala dan foydalaning (6A-rasm va SI ilovasi, S2-jadval).SARS-CoV-2 nsp12 dagi K4465 HCoV-229E dagi K4135 ga mos keladi (SI ilovasi, S2-rasm), bu NiRAN faoliyati va HCoV-229E replikatsiyasi uchun zarur ekanligi isbotlangan (3D va E-rasm).Bu qoldiq, shuningdek, EAV nsp9 K94 arterial virusi qoldig'iga ham to'g'ri keladi, bu avvalroq NiRANning o'z-o'zini UMPilatsiyasi/o'z-o'zidan GMPilatsiyasi uchun zarur ekanligi ko'rsatilgan (16).6B-rasmda ko'rsatilganidek, SARS-CoV-2 nsp12 substrat sifatida nsp9 dan foydalangan holda UMP transferaza faolligiga ega, nsp12_K4465A faol sayt mutant esa faol emas.RdRp motifi C ning SDD xarakteristikasi ketma-ketligidagi ikki marta almashtirish UMP transferaza faolligiga ta'sir qilmaydi (6B-rasm), bu RdRp faolligi nsp9 UMPylyatsiyasiga bevosita ta'sir qilmasligini ko'rsatadi.Shunga o'xshash ma'lumotlar CTP, GTP va ATP yordamida olingan (SI ilovasi, S10-rasm).Xulosa qilib aytganda, ushbu ma'lumotlar NiRAN vositachiligidagi nsp9 NMPylation ortokoronavirus subfamiliyasining turli avlodlarini ifodalovchi koronaviruslarda konservativ faollikka ega ekanligini ko'rsatadi.
SARS-CoV-2 nsp12 vositachiligida nsp9 NMPilatsiyasi.(A) NMPylation testida ishlatiladigan rekombinant oqsilni ko'rsatadigan Coomassie bo'yalgan SDS-poliakrilamid jeli.Nazorat sifatida SARS-CoV-2 nsp12 ning NiRAN domenida (K4465A) va RdRp domenida (DD5152/3AA) faol joy almashinadigan mutant oqsili ishlatilgan.Qoldiqlarni raqamlash pp1ab dagi joylashuvga asoslanadi.(B) nsp12-His6 substrati sifatida nsp9-His6 va [a-32P]UTP yordamida UMPylyatsiyani aniqlashning avtoradiografi (yovvoyi turdagi [wt] va mutant).Belgilangan oqsilning molekulyar massasi (kilodaltonlarda) chap tomonda ko'rsatilgan.
NiRAN domenlari odatda Nidoviralesda (16) saqlanadi, bu ular Nidovirus replikatsiyasi uchun zarur bo'lgan fermentativ reaktsiyalarni katalizlashini ko'rsatadi.Ushbu tadqiqotda biz koronavirusning NiRAN domeni NMP ni (NTP dan hosil qilingan) nsp9 ga, virus replikatsiyasida ishtirok etadigan sirli RNK bog'lovchi oqsilga (26 ?? 29) o'tkazishini isbotlay oldik va uni tabiiy maqsad sifatida aniqlashga muvaffaq bo'ldik. koronavirus RTC hamkori.
NiRAN domeni uchta ketma-ketlik motivlarini (AN, BN va CN) baham ko'radi, ular juda oz sonli qoldiqlarni o'z ichiga oladi, ular monofiletik, ammo yuqori darajada farqlangan Nidovirales tartibida barcha oilalarda saqlanadi (8, 16).Yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, ular dastlab SelO oilasi (17, 19, 22, 30, 31).SelO bilan bog'liq oqsillar kinaz burmalariga ega, ammo klassik kinazalarda bir nechta saqlanib qolgan faol sayt qoldiqlari yo'q (22, 32).Faol joy bilan bog'langan va o'ziga xos o'zaro ta'sirlar bilan barqarorlashtirilgan ATP molekulalarining teskari yo'nalishiga asoslanib, SelO gipoteza qilindi va keyinchalik AMP (fosfat o'rniga) oqsil substratiga (22) o'tkazilishi tasdiqlandi, boshqa bakterial SelO ga o'xshash YdiU oqsili mavjud. yaqinda UMP ning Tyr va uning qoldiqlariga kovalent biriktirilishini katalizlashi ko'rsatilgan (33).
Koronavirus NiRAN domenining taxminiy faol sayt qoldiqlari prognozini tasdiqlash va kengaytirish uchun biz nsp12 koronavirusida mutatsiyani tahlil qilish uchun biokimyoviy va teskari genetik usullardan foydalandik (3D va E va SI ilovasi, S3-rasm va jadval) S1â S4).Ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, HCoV-229E K4135, R4178 va D4280 ning Ala bilan almashtirilishi in vitro NMP transferaza faolligini va hujayra madaniyatida virus replikatsiyasini yo'q qiladi (3D va E va SI qo'shimchalari, S3-rasm), ularning NTP g-fosfatida mavjudligini qo'llab-quvvatlaydi. (K4135, R4178) va faol sayt metall ionlarini muvofiqlashtirish (D4280).K4135 (17) pozitsiyasini barqarorlashtirish uchun taxmin qilingan qush uyasi virusi oralig'ida E4145A konservatsiyalangan Glu bilan almashtirilishi virus replikatsiyasini bartaraf etishi ko'rsatildi, ammo hayratlanarlisi, faollik in vitro NMPylyatsiya tahlilida saqlanib qoldi (3D va E-rasmlar va SI ilovasi, S3-rasm va S1–S4 jadvallari).Shunga o'xshash kuzatuv Salmonella typhimurium (E130A) (33) ning YdiU homologida tegishli almashtirish kiritilganda amalga oshirildi.Birgalikda bu ma'lumotlar katalitik funktsiyani emas, balki ushbu saqlanib qolgan qoldiqning tartibga solish funktsiyasini qo'llab-quvvatlaydi.
Konservalangan Phe qoldig'ini (F4281A) HCoV-229E NiRAN domenidagi (8) nestovirus oralig'ida almashtirish in vitro NMPillanish faolligining pasayishiga va hujayra madaniyatida virus replikatsiyasining sezilarli pasayishiga olib keldi (3D, E va SI-rasm). ilova, S3-rasm).Ma'lumotlar ushbu qoldiqning muhim tartibga solish funktsiyasiga mos keladi, masalan, ilgari ko'rsatilgan gomologik DFG motifi Phe qoldig'i.Klassik protein kinazalarida u Mg2+ bog'lovchi halqaning bir qismi bo'lib, umurtqa pog'onasini yig'ish va tartibga solishga yordam beradi???Samarali katalitik faollik uchun zarur (32, 34).K4116 qoldiqlari uchun Ala va Arg ni almashtirish (preAN motivida) mos ravishda virus replikatsiyasini yo'q qildi va kutilganidek, kiritilgan aminokislota yon zanjiriga qarab in vitro NMP transferaza faolligiga turli xil ta'sir ko'rsatdi (3D va E va SI qo'shimchalari-rasm). , S3-rasm).Funktsional ma'lumotlar strukturaviy ma'lumotlarga mos keladi, bu qoldiqning ATP fosfat bilan o'zaro ta'sirini o'rnatganligini ko'rsatadi (17).Boshqa ichki o'rnatilgan virus oilalarining NiRAN domenida HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 o'rnini Lys, Arg yoki His (8) egallagan bo'lib, bu o'ziga xos qoldiqning funksional cheklanishi yumshatilganligini ko'rsatadi.D4188A va D4283A almashtirilishi ferment faolligini yo'q qiladi yoki kuchli kamaytiradi va virus replikatsiyasini yo'q qiladi (3-rasm).Ushbu ikkita qoldiq ko'pchilik (ammo hammasi emas) ichki o'rnatilgan viruslarda (8) saqlanadi, bu oilaga xos, ammo katalitik bo'lmagan muhim funktsiyani ko'rsatadi.Nazorat sifatida Coronaviridae yoki boshqa Nestioviridae oilalarida (8) saqlanmagan bir qancha boshqa Lys va Asp qoldiqlarining (K4113A, D4180A, D4197A va D4273A) Ala almashtirishlari ishlatilgan.Kutilganidek, bu almashtirishlar asosan toqat qilinadi, ba'zi hollarda ferment faolligi va virus replikatsiyasi biroz pasayadi (3-rasm va SI ilovasi, S3-rasm).Umuman olganda, koronavirus mutagenezi ma'lumotlari EAV NiRAN-RdRp (16) ning o'z-o'zidan GMP va teskari genetik ma'lumotlariga juda mos keladi, bunda EAV nsp9 (koronavirus nsp12 orthologi) qoldig'i K94 (HCoV- 229E K4135 ga mos keladi) muhim funktsiyalarni bajaradi), R124 (R4178 ga mos keladi), D132 (D4188 ga mos keladi), D165 (D4280 ga mos keladi), F166 (F4281 ga mos keladi).Bundan tashqari, HCoV-229E mutagenezi maʼlumotlari ilgari eʼlon qilingan SARS-CoV teskari genetik maʼlumotlariga (16) mos keladi va kengaytiriladi, xuddi Fe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 mos keladigan CN motivi uchun kuzatilganlarga juda oʻxshash. tasvirlangan fenotip -F219A va HCoV-229E_F4281A (3-rasm D va E va SI ilovasi, S3-rasm va S1-S4-jadval).
UTP va GTP (o'z-o'zidan NMPylation reaktsiyasida) uchun aniq afzalliklarga ega bo'lgan EAV ortologlari (16) bilan solishtirganda, bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatadiki, koronavirus NiRAN domeni (HCoV-229E va SARS-CoV-2 tomonidan ifodalanadi) samarali bo'lishi mumkin. ko'chirildi Barcha to'rtta NMP, garchi UMP uchun ozgina afzallik mavjud bo'lsa ham (1 va 3-rasm).Maxsus NTP ko-substratining nisbatan past o'ziga xosligi yaqinda xabar qilingan SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkompozit tuzilmasiga mos keladi, unda ADP-Mg2+ NiRANning faol joyiga bog'lanadi, lekin adenin qismi bilan bog'lanmaydi. o'ziga xos o'zaro ta'sirlarning shakllanishi (17).Bizning tadqiqotimizda NMPillanish reaksiyasida ishlatiladigan nukleotid turi mutant oqsilning faolligiga differensial ta'sir ko'rsatmaydi (SI ilovasi, S3-rasm), bu qoldiqlarning hech biri o'ziga xos nukleobazaning bog'lanishi bilan chambarchas bog'liq emasligini ko'rsatadi.Koronaviruslar va arterial viruslarning NiRAN domenlarida kuzatilgan turli NTP ko-substrat imtiyozlarining tarkibiy asoslari va potentsial biologik ahamiyati o'rganilishi kerak;ular to'g'ri bo'lishi mumkin yoki ularning tegishli tadqiqotlari cheklovlari tufayli bo'lishi mumkin.Hozirgi vaqtda arterial virus va koronavirus o'rtasidagi o'xshashlikni hisobga olgan holda, NiRAN domenining arterial virusining potentsial NMPyator faolligi (avval tavsiflangan o'z-o'zini NMPylyatsiya faoliyati bilan solishtirganda) boshqa ko-substrat afzalligiga ega ekanligini istisno qilib bo'lmaydi. NiRAN domeni chegarasida.Ketma-ketlik asosida solishtiring (16).Mg2+ dan kofaktor sifatida foydalanadigan psevdokinaz SelO bilan solishtirganda, koronavirus va arterial virus NiRAN faolligi Mn2+ ga bog'liq (16) (3C-rasm va SI ilovasi, S1-rasm).Mn2+ga bog'liqlik va UTPga aniq ustunlik NMPylyator oqsilining g'ayrioddiy xususiyati bo'lib, yaqinda Salmonella typhimuriumning YdiU oqsilida tasdiqlangan bo'lib, u hujayralarni stress induktsiyasidan himoya qilish uchun qattiq Mn2+ ga bog'liq bo'lgan protein chaperon UMPilatsiyasini katalizlaydi. 33).
Koronavirusning NiRAN domeni va hujayra protein kinazlari o'rtasidagi yaqinda tavsiflangan tarkibiy o'xshashlik (17, 19) NiRANning NMP ni biz ushbu tadqiqotda xabar bergan boshqa oqsillar bilan kovalent bog'lash qobiliyatiga qo'shimcha yordam beradi.Biz NiRAN maqsadlarini qidirishni HCoV-229E ORF1a tomonidan kodlangan oqsillarga qaratdik, ular to'g'ridan-to'g'ri yoki bilvosita RTC ning ORF1b kodlangan replikaziga yordam berishi ma'lum (12, 35).Bizning tajribalarimiz nsp9 ning samarali va o'ziga xos NMPilatsiyasi uchun ishonchli dalillarni taqdim etadi (2-rasm).Agar maqsadli protein ferment (nsp12)nikidan 8-10 baravar yuqori bo'lgan molyar ortiqcha miqdorda ishlatilsa, nsp9 to'liq (mono) NMPlanganligi tasdiqlanadi (4-rasm).Biz nsp12 va nsp9 o'rtasidagi o'zaro ta'sir qisqa muddatli va nsp9 bilan barqaror kompleks hosil qilmaydi degan xulosaga keldik (boshqa RTC bo'linmalari mavjud bo'lmaganda).Ushbu xulosa SARS-CoV proteomidagi oqsillarning o'zaro ta'sirini o'rganish bilan tasdiqlangan (35).MS tahlili nsp9 ning N-terminal qoldig'ining asosiy amini NMPillanish joyi sifatida aniqladi (SI ilovasi, S5-rasm).Fosforamidat bog'lanishi va N-terminal aminokislotalarning hosil bo'lishi NiRAN vositachiligidagi NMPylanish faolligini Pseudomonas syringae SelO vositachiligidagi AMPillanish reaktsiyasidan ajratib turadi, bu Ser, Thr yoki Tyr qoldiqlarida O-bog'langan AMP hosil bo'lishini katalizlaydi Peptid qo'shimchasi ( 22), va S. typhimurium YdiU O-bogʻlangan (Tyr bilan) va N-bogʻlangan (His bilan) peptid-UMP qoʻshimchalarini hosil qiladi.SelO oqsillari oilasi haqidagi cheklangan ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, bu katta protein oilasi a'zolari peptid-NMP qo'shimchalarini shakllantirishda juda farq qiladi.Bu qo'shimcha o'rganishga loyiq qiziqarli kuzatuv.
Ushbu tadqiqotda olingan ma'lumotlar bizni nsp9 ning NMPilatsiyasi bepul N-terminalni talab qiladi degan farazga olib keldi.??Manzil (36).The peptide cleavage data obtained in the early studies showed that the cleavage efficiency of the nsp8|nsp9 site was lower than that of other sites, indicating that 1) this specific site may have a regulatory role in the timely coordinated processing of the C-terminal pp1a mintaqasi yoki 2) a Virus replikatsiyasida maxsus saqlangan nsp9 N-terminalining roli (37).Bizning ma'lumotlarimiz (5A-rasm) haqiqiy N-terminal ketma-ketligini tashuvchi nsp9 ning rekombinant shakli nsp12 tomonidan samarali NMPlanganligini ko'rsatdi.N-terminal yonma-yon ketma-ketligi Xa omili (nsp9-His6; SI ilovasi, S1-jadval) yoki Mpro vositachiligida bo'linish (nsp7-11-His6; 5A-rasm va SI ilovasi, S1-jadval) bilan olib tashlandi.Muhimi, kesilmagan nsp9 o'z ichiga olgan prekursor nsp7-11-His6 nsp12 ning NMPilatsiyasiga qarshilik ko'rsatdi, bu bizning ma'lumotlarimizga mos keladi, bu nsp9-NMP qo'shimchasi N-terminal birlamchi amin orqali hosil bo'lganligini ko'rsatadi (SI ilovasi, S5-rasm). .NiRAN substratining o'ziga xosligini chuqurroq tushunish uchun biz nsp9 ning qo'shni N-terminal qoldiqlariga e'tibor qaratdik.In the absence of other proteins, they are structurally flexible, preventing them from being detected in the unlabeled form of nsp9 (26 28, 38), indicating their limited natural variation This is due to the important sequence-specific (not secondary structure related) nsp9 N-terminal fragmentining funktsiyasi.Ala substitutions of conserved residues in this region (Figures 5C and D and SI appendix, Figure S8) reveal that N3826 is essential for nsp9 NMPylation in vitro, while N3825A and E3827A substitutions lead to a decrease in NMPylation, while M3829A and P3830A substitutions do not .Shubhasiz nsp9 NMPylation ta'sir qiladi.N-terminal Asn (N3825A, N3825S) almashtirilishi hujayra madaniyatida nsp9 NMPilatsiyasi va virus replikatsiyasiga o'rtacha ta'sir ko'rsatsa ham (5C va D-rasm), N-terminal 3825-NN dipeptididan Asn qoldiqlari ketma-ketligini o'chirish. Bu viruslar uchun o'limga olib keladi, bu N-terminusdagi boshqa qoldiqdan oldin bitta Asn qoldig'i, yaxshisi Asn bo'lishi kerakligini ko'rsatadi, garchi shunga o'xshash qoldiqlarni almashtirishga qisman toqat qilish mumkin bo'lsa ham (5B, C va D-rasm).Biz 3825-NN dipeptidi, ayniqsa, koronavirus diapazonidagi saqlanib qolgan va muhim N3826 qoldig'i (SI ilovasi, S6-rasm) NiRANning faol joyida nsp9 N-terminusining to'g'ri bog'lanishi va yo'nalishini ta'minlaydi degan xulosaga keldik.
Ala (E3827A) ni barcha kichik oilalarning konservalangan Glu o‘rniga qo‘yish in vitro nsp9 NMPillanishini saqlab qoladi, lekin hujayra madaniyatidagi viruslar uchun o‘limga olib keladi (5C va D-rasm), bu qoldiqning qo‘shimcha funktsiyasini ko‘rsatadi, masalan, asosiy o‘zaro ta’sirlarda (NMPylangan yoki o‘zgartirilmagan). ) nsp9 N-terminali va virus replikatsiyasida ishtirok etuvchi boshqa omillar.Nsp9 mutatsiyalari nsp9 yoki qo'shni nsps (39) ning proteolitik jarayoniga ta'sir qilmadi (SI ilovasi, S9-rasm), bu kuzatilgan bir nechta nsp9 mutatsiyalarining halokatli fenotiplari C proteolitik jarayon-terminal pp1a maydonining disregulyatsiyasi tufayli yuzaga kelmaganligini ko'rsatadi. .
Yuqoridagi ma'lumotlar pp1a/pp1ab da nsp8|9 parchalanish joyini Mpro vositachiligida davolashdan so'ng, nsp9 ning N-terminalini UMPyated (yoki qisman boshqa NMP bilan o'zgartirilishi) mumkinligini isbotlaydi.Bundan tashqari, nsp9 ning N-terminali (koronavirus oilasidagi yagona va o'zgarmas Asn qoldiqlarini o'z ichiga olgan holda) va ushbu tadqiqotda olingan teskari genetik ma'lumotlar (3E va 5D-rasm) mukammal saqlanishi bizni ta'riflangan nsp9 NMPilatsiyasi degan xulosaga olib keldi. biologik bog'liq va koronavirus replikatsiyasi uchun zarurdir.Ushbu modifikatsiyaning funktsional oqibatlari, masalan, ilgari tasvirlangan (o'ziga xos bo'lmagan) nsp9 (o'zgartirilmagan shakl) RNKni bog'lash faolligi (2628) bilan bog'liq holda o'rganilishi kerak.N-terminal NMPilatsiyasi, shuningdek, nsp9 ning oqsil yoki RNK substratlari bilan o'zaro ta'siriga yoki turli xil to'rt darajali birikmalarning shakllanishiga ta'sir qilishi mumkin.Ular strukturaviy tadqiqotlarda kuzatilgan va koronavirus replikatsiyasi bilan funktsional bog'liqligi tasdiqlangan, garchi bu modifikatsiya bo'lmasa ham (26- ââ29, 40).
Koronavirus NiRAN domenining maqsadli o'ziga xosligi hali ham batafsilroq tavsiflanishi kerak bo'lsa-da, bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, NiRAN koronavirus domenining oqsil maqsadli o'ziga xosligi juda tor.Although the conservation of key active site residues (8, 16) in the NiRAN domain of all nidovirus families strongly supports the activity of the conserved NMPylator these proteins, the identity of the substrate binding pocket residues of this domain Conservation and conservation remain to be characterized , va Nidovirales maqsadlarining turli oilalari orasida farq qilishi mumkin.Xuddi shunday, boshqa ichki viruslarning tegishli maqsadlari hali aniqlanmagan.Ular nsp9 yoki boshqa oqsillarning uzoq ortologlari bo'lishi mumkin, chunki odatda ichki o'rnatilgan viruslarda saqlanadigan besh replikaza domenidan tashqaridagi ketma-ketliklar kamroq saqlanadi (8), Mpro va NiRAN o'rtasidagi genomlar qatori, Ular orasida nsp9 joylashgan. Korona virus.
Bundan tashqari, biz hozirda NiRAN domenida qo'shimcha (jumladan, uyali) maqsadlarga ega bo'lish imkoniyatini istisno qila olmaymiz.Bunday holda, shuni ta'kidlash kerakki, ushbu yangi paydo bo'lgan NMPylators (NMPylators) oqsilidagi bakterial gomologlar (30, 31) "master regulyatorlarga" ega ko'rinadi?NMP turli xil hujayrali oqsillarni ularning quyi oqimidagi faoliyatini tartibga solish yoki yo'q qilish uchun modulyatsiya qiladi va shu bilan turli xil biologik jarayonlarda rol o'ynaydi, masalan, hujayra stressiga javob va redoks gomeostazi (22, 33).
Ushbu tadqiqotda (2 va 4-rasmlar va SI ilovasi, S3 va S5-rasmlar) biz nsp12 UMP (NMP) qismini nsp9 da bitta (konservatsiyalangan) holatga o'tkazganini, boshqa oqsillar esa o'zgartirilmaganligini isbotlay oldik. Foydalanilgan Shartlar ostida, yaxshi belgilangan (bo'sh emas) substrat o'ziga xosligi qo'llab-quvvatlanadi.Shunga mos ravishda, N-terminal nsp9 NMPylation bilan solishtirganda, nsp12ning o'z NMPylation faolligi juda past, uni aniqlash avtoradiografiya ta'sir qilish vaqtini ko'proq talab qiladi va nsp12 kontsentratsiyasining 10 baravar oshishi ishlatiladi.Bundan tashqari, bizning MS tahlilimiz nsp12 ning NMPillanishiga dalil keltira olmadi, bu NiRAN domenining o'z-o'zidan NMPyatsiyasi (eng yaxshi holatda) ikkinchi darajali faoliyat ekanligini ko'rsatadi.Ammo shuni ta'kidlash kerakki, boshqa tadqiqotlar bakterial NMPilatorning o'z-o'zidan AMPillanish holati ularning boshqa oqsil substratlarida NMPillanish faolligini nazorat qilishi mumkinligi haqida dastlabki dalillarni taqdim etdi (22, 33).Shuning uchun, EAV nsp9 (16) va koronavirus nsp12 (ushbu tadqiqot) uchun bildirilgan o'z-o'zidan NMPylyatsiya faoliyatining mumkin bo'lgan funktsional ta'sirini, shu jumladan C-terminal RdRp domenining katlanishiga taklif qilingan chaperonga o'xshash ta'sirini o'rganish uchun ko'proq tadqiqotlar talab etiladi. 16) ).
Ilgari, nidoviral NiRAN domenining mumkin bo'lgan quyi oqim funktsiyalariga oid bir nechta farazlar ko'rib chiqildi, jumladan RNK ligaza, RNK bilan qoplangan guanilat transferaza va oqsillarni tayyorlash faolligi (16), ammo ularning hech biri mavjud bo'lgan quyi oqim funktsiyalariga mos kelmaydi.Quyidagi pozitsiyalarda olingan ma'lumotlar qo'shimcha taxminlarsiz aynan bir xil vaqt.Ushbu tadqiqotda olingan ma'lumotlar NiRAN domeni oqsil bilan bog'liq RNK sintezining boshlanishida ishtirok etishiga eng mos keladi (lekin isbotlay olmaydi).Ilgari NiRAN domenining vazifasi 5 ??²-RNKni yopish yoki RNKni bog'lash reaktsiyalariga bular ta'sir qilmaydi va boshqa ma'lumotlarni qo'llab-quvvatlash.Shuning uchun, masalan, NiRAN ning faol joyi umumiy asos sifatida saqlanib qolgan Asp ni o'z ichiga oladi (Pseudomonas syringae SelO'da D252; HCoV-229E pp1abda D4271; SARS-CoV-2 nsp12da D208) (SI ilovasi, 2-rasm) ).S2) (17, 22, 33), ATPga bog'liq bo'lgan RNK ligaza va RNKni yopish fermentida kataliz kovalent ferment-(lizil-N)-NMP oraliq mahsuloti tomonidan amalga oshiriladi, bu o'zgarmagan Lys qoldig'ini o'z ichiga oladi ( 41).Bundan tashqari, konservalangan oqsil maqsadlari uchun NiRAN koronavirusining ajoyib ketma-ketlikka asoslangan o'ziga xosligi va NTP ko-substratlari uchun bo'shashgan o'ziga xoslik (UTP ni afzal ko'radi) NiRAN vositachiligidagi yopish fermenti yoki RNK ligazaga o'xshash funktsiyalarga qarshi turadi.
Shubhasiz, tekshirish va agar isbotlangan bo'lsa, nsp9-UMP (nsp9-NMP) ning oqsil bilan induktsiyalangan RNK sintezidagi mumkin bo'lgan rolini ishlab chiqish uchun ko'p qo'shimcha ish talab etiladi, bu bir nechta qiziqarli, ammo (hozircha) ilgari xabar qilingan hisobotlarni bog'laydi. .Izolyatsiya qilingan kuzatuvlar.Masalan, koronavirusning manfiy zanjirli RNKsining oxiri oligo(U) zanjiridan boshlanishi aniqlangan (42, 43).Ushbu kuzatish manfiy zanjirli RNK sintezi nsp9 ning UMPylangan shaklini poli(A) dumiga (triggerlar) bog'lash orqali boshlanadi, degan g'oyaga mos keladi, bu RNK bilan bog'lanishi faolligi va/yoki o'zaro ta'siri bilan ta'minlanishi mumkin. boshqa RTC oqsili.nsp9 tomonidan taqdim etilgan UMP qismi keyinchalik genomik RNKdagi 3?²-poli(A) dumidan yoki boshqa oligo (A) o'z ichiga olgan ketma-ketlikdan foydalanib, nsp7/8/nsp12 vositachiligida oligouridilatsiya uchun "primer" sifatida ishlatilishi mumkin. picornavirus VPg oqsili uchun o'rnatilgan mexanizmga o'xshash shablon bo'lib xizmat qiladi (44).Agar taklif "normativ" bo'lsa-chi????(Oqsil bilan qo'zg'atilgan) manfiy zanjirli RNK sintezining boshlanishi kuzatuvlar bilan bog'lanishni ta'minlaydi, bu esa koronavirusning manfiy zanjirli RNKsi oxirida UMP (UTP o'rniga) mavjudligini ko'rsatadi (42), bu shuni ko'rsatadiki, Dicer nuklein kislotasi noma'lum uridinga xos endonukleaza bilan fosforlangan uchini parchalaydi.Agar tasdiqlansa, nuklein kislotaning gidrolitik faolligi nsp9 ning oligomerik UMPylangan shaklini yangi paydo bo'lgan salbiy ipning 5 ² uchidan chiqarishga yordam beradi.Nsp9 ning oqsillarni tayyorlashdagi mumkin bo'lgan roli, shuningdek, nsp9 (va nsp8) koronavirus genomining 3-uchiga yaqin joylashgan sis-ta'sir qiluvchi RNK elementi bilan tanqidiy va aniq o'zaro ta'sir qilishini ko'rsatgan oldingi teskari genetik tadqiqotlar bilan mos keladi.45).Ushbu hisobotga ko'ra, ushbu oldingi kuzatuvlar endi keyingi tadqiqotlar orqali qayta tekshirilishi va kengaytirilishi mumkin.
Xulosa qilib aytganda, bizning ma'lumotlarimiz N-terminusda RdRp bilan bog'langan xususiy o'rnatilgan virus fermenti tegining o'ziga xos faolligini aniqladi.Koronavirusda ushbu yangi kashf etilgan NiRAN vositachiligidagi UMPylator/NMPylator faolligi Mn2+ va qoʻshni Asn qoldiqlariga tayanish va N-terminal birlamchi amin bilan (past energiyali) fosforamidat bogʻlanishlarini hosil qilish uchun ishlatiladi.Nsp8|9 ajralish joyida Mpro vositachiligida bo'linish orqali nsp9 maqsadi NMPylation uchun ishlatilishi mumkin, bu proteaz va RdRpgacha cho'zilgan NiRAN domeni o'rtasidagi funktsional bog'lanishni ko'rsatadi.Nsp12 NiRAN faol saytida va nsp9 nishonidagi asosiy qoldiqlarning saqlanishi, ikkita koronavirusdan, shu jumladan SARS-CoV-2dan olingan ma'lumotlar bilan birgalikda, nsp9 NMPylyatsiyasi koronavirus ekanligiga kuchli dalil beradi Konservativ xususiyatlar ham virus replikatsiyasining asosiy bosqichidir.Mavjud ma'lumotlar bizni NMP9 ning NMPylangan shaklining oqsil bilan qo'zg'atilgan RNK sintezidagi o'ziga xos roli koronavirus va boshqa ichki viruslar uchun oqilona stsenariydir va NiRAN boshqa noma'lum oqsillarni ham nishonga olishi mumkin degan xulosaga kelishimizga olib keladi.Virusni tartibga soling.Xost o'zaro ta'siri.Tasdiqlansa, virusli RNK sintezida oqsil primerlarining ishtiroki Mpro/3CLpro va RdRp domenlarining avval aniqlangan koronavirus va pikornavirusga o'xshash superguruh (9) o'rtasidagi ketma-ketlik yaqinligini oshiradi, ular hozirda yaqinda tashkil etilgan Pisoniviritlarda (9) 46) toifasida.
Bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, ushbu tadqiqotda aniqlangan asosiy, selektiv va konservativ ferment faolligi antiviral preparatlar uchun maqsad sifatida ishlatilishi mumkin.Konservalangan nsp9 N-terminalining NiRANning faol joyida bog'lanishiga (va keyinchalik o'zgarishiga) xalaqit beradigan birikmalar turli xil (sub) jinsdagi infektsiyalardan hayvonlar va odam koronaviruslarini davolash uchun mos keladigan samarali va ko'p qirrali antiviral preparatlarga aylantirilishi mumkin. SARS-CoV-2 va Yaqin Sharq respirator sindromi Coronavirusni o'z ichiga oladi.
pMAL-c2 (Yangi Angliya biologik laboratoriyasi) yoki pASK3-Ub-CHis6 (47) ifoda vektori (SI ilovasi, S1 va S2 jadvallari).Yagona kodon almashtirishlari PCR-ga asoslangan saytga yo'naltirilgan mutagenez orqali kiritilgan (48).MBP termoyadroviy oqsilini ishlab chiqarish uchun E. coli TB1 hujayralari tegishli pMAL-c2 plazmid konstruktsiyasi bilan o'zgartirildi (SI ilovasi, S1-jadval).Birikish oqsili amilozaga yaqinlik xromatografiyasi bilan tozalandi va Xa omili bilan parchalandi.Keyinchalik, C-terminal His6 yorlig'i bilan belgilangan oqsil, ilgari tavsiflanganidek, Ni-immobilizatsiyalangan metallga yaqinlik xromatografiyasi (Ni-IMAC) bilan tozalandi (49).Transformatsiya (47).C-terminal His6 yorlig'i bo'lgan koronavirus oqsili yuqorida tavsiflanganidek tozalandi (50).
HCoV-229E nsp12-His6 ning o'z-o'zidan NMPilatsiya testi EAV nsp9 (16) da tavsiflanganidek amalga oshirildi.In short, nsp12-His6 (0.5 µM) contains 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol ( DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM buffer, incubate belgilangan NTP va 0,17 mkM [a32-P]NTP (3000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) 30 °C da 30 daqiqa davomida mos keldi.In all other (standard) NMPylation assays of nsp12-mediated nsp9 NMPylation, the reaction conditions are adjusted as follows: nsp12-His6 (0.05 µM) and nsp9-His6 (4 µM) in the presence of 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0 ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 mkM NTPni ko‘rsatdi va 0,17 mM [a32-P]NTP ga mos keldi.30 ° C da 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilingandan so'ng, reaksiya namunasi SDS-PAGE namunasi tamponi bilan aralashtirildi: 62,5 mM tris (gidroksimetil) aminometan HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% glitserin va 0,00% bromofenol. ko'k.Protein 5 daqiqa davomida 90 ° C da qizdirilganda denatüratsiya qilingan va 12% SDS-PAGE bilan ajratilgan.The gel is fixed and stained with Coomassie Brilliant Blue solution (40% methanol, 10% acetic acid, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), decolorized, and exposed to a phosphorescent imaging screen for 20 hours (to detect nsp12 from NMPylation) yoki (maksimal) 2 soat (nsp9 NMPilatsiyasini baholash uchun).Ekranni skanerlash uchun Typhoon 9200 tasvirlagichi (GE Healthcare) va signal intensivligini tahlil qilish uchun ImageJ ishlatildi.
MS tahlili uchun 1 µM nsp12-His6 va 10 µM nsp9 (geksahistidin yorlig‘isiz) NMPilatsiya tahlilida (SI ilovasi, S1-jadval) ishlatilgan va 500 mkM UTP va GTP kontsentratsiyasining ortishi ishlatilgan.Ularning kontsentratsiyasi va kutilayotgan oqsil sifatiga qarab, 1 dan 10 µL buferlangan oqsil eritmalarini onlayn tuzsizlantirish uchun MassPrep ustuni (Suvlar) bilan jihozlangan Waters ACQUITY H-Class HPLC tizimi ishlatilgan.Tuzsizlangan oqsil Synapt G2Si massa spektrometrining (Suvlar) elektrosprey ion manbaiga A buferi (suv/0,05% chumoli kislotasi) va B buferi (asetonitril/0,045% chumoli kislotasi) ning quyidagi gradienti orqali elutsiya qilinadi va ustun harorati 60 ° C va 0,1 ml / min oqim tezligi: 2 daqiqa davomida 5% A bilan izokratik ravishda, so'ngra 8 daqiqa ichida 95% B ga chiziqli gradient bilan elutsiya qiling va yana 4 daqiqa davomida 95% B ni saqlang.
Massa diapazoni 500 dan 5000 m/z gacha bo'lgan musbat ionlar aniqlanadi.Glu-fibrinopeptid B har 45 soniyada massa siljishini avtomatik tuzatish uchun o'lchanadi.MaxEnt1 kengaytmali MassLynx asbob dasturidan asosiy chiziqni ayirib, tekislashdan so'ng o'rtacha spektrni ajratish uchun foydalaning.
UMPylated HCoV-229E nsp9 ketma-ketlik darajasi o'zgartirilgan tripsin (Serva) qo'shilishi bilan hazm qilindi va bir kechada 37 ° C da inkubatsiya qilindi.Peptidlarni tuzsizlantirish va konsentratsiyalash uchun Chromabond C18WP spin ustuni (qism raqami 730522; Macherey-Nagel) ishlatilgan.Nihoyat, peptid 5% asetonitril va 0,1% chumoli kislotasi bo'lgan 25 mL suvda eritildi.
Namunalar MS tomonidan Orbitrap Velos Pro massa spektrometri (Thermo Scientific) yordamida tahlil qilindi.Oxirgi nanoâ HPLC tizimi (Dionex), maxsus uchi o'rnatilgan 50 sm ??2,4 mkm magnit boncuklar bilan o'ralgan 75 mkm C18 RP ustuni (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Proxeon nanospray manbai orqali onlayn ravishda massa spektrometriga ulaning;300 mkm ichki diametrga 6 µL tripsin hazm qilish eritmasini yuboring ×??1 sm C18 PepMap konsentratsiyadan oldingi ustun (Termo Scientific).Erituvchi sifatida suv/0,05% chumoli kislotasi yordamida namuna avtomatik ravishda ushlandi va 6 µL/min oqim tezligida tuzsizlantirildi.
Triptik peptidlarni 300 nL/min oqim tezligida ajratish uchun quyidagi suv/0,05% chumoli kislotasi (erituvchi A) va 80% asetonitril/0,045% chumoli kislotasi (erituvchi B) gradientlari ishlatilgan: 4% B uchun 5 daqiqa, keyin 30 A chiziqli gradient daqiqalar ichida 45% B ga va 5 daqiqa ichida 95% erituvchi B ga chiziqli o'sish.Xromatografik ustunni zanglamaydigan po'latdan yasalgan nano-emitterga (Prokseon) ulang va 2300 V potentsialdan foydalangan holda elyuentni to'g'ridan-to'g'ri massa spektrometrining qizdirilgan kapillyariga püskürtün. Orbitrap massa analizatorida 60 000 ruxsatli tadqiqot skaneri bog'langan. kamida uchta ma'lumot bilan MS/MS skanerlashi, dinamik ravishda 30 soniya davomida chiqarib tashlangan, chiziqli ion tutqichlari to'qnashuvi natijasida kelib chiqqan dissotsiatsiya yoki orbitrapni aniqlash bilan birlashtirilgan yuqori energiyali to'qnashuv dissotsiatsiyasidan foydalangan holda, Ruxsat 7,500.
Yuborilgan vaqt: 2021 yil 03-avgust